Mise au point d’un modèle in vitro d’exposition continue au peroxyde d’hydrogène et a l’hypothiocyanate pour étudier la résistance à la réponse antibactérienne oxydative épithéliale de Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus - 17/02/23

L’épithélium respiratoire est ouvert sur le milieu extérieur et nécessite des mécanismes permanents de résistance aux agressions, notamment bactériennes. Un de ces mécanismes repose sur la production continue d’espèces oxygénées réactives : le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et l’hypothiocyanate (OSCN-). Cette production est assurée respectivement par les protéines dual oxydase et la lactoparoxydase (LPO). Afin d’étudier la résistance au stress oxydatif de différentes souches bactériennes, deux modèles in vitro de production continue d’H2O2 et d’OSCN- ont été développés et pleinement caractérisés. Si des modèles d’exposition ponctuelle étaient déjà décrits, un seul article mentionnait une exposition continue, plus physiologique, sans caractériser précisément les espèces obtenues [1Patel U., Gingerich A., Widman L., Sarr D., Tripp R.A., Rada B. Susceptibility of influenza viruses to hypothiocyanite and hypoiodite produced by lactoperoxidase in a cell-free system PLoS One 2018 ;  13 : e0199167

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Ces modèles ont d’abord été mis au point avec Pseudomonas aeruginosa PA14 à des inocula de 107, 105, 104 et 102UFC/mL correspondant aux charges significatives de différents prélèvements cliniques (examen cytobactériologique de crachat, lavage bronchoalvéolaire et prélèvement distal protégé) ainsi que l’inoculum habituellement utilisé pour les études in vitro dans la littérature. Ensuite, la résistance à la réponse antibactérienne oxydative de l’épithélium respiratoire de deux pathogènes habituellement impliquées dans des pneumopathies nosocomiales, Staphylococcus aureus et P. aeruginosa, a été évaluée. Deux souches de référence et 5 souches cliniques de résistance croissante aux antibiotiques ont été sélectionnées pour chacun de ces pathogènes.

Le modèle de production continue d’H2O2 a été obtenu par oxydation du D-glucose par la glucose oxydase. Des dosages répétés dans le temps ont ensuite été effectués pour caractériser le modèle obtenu. Le modèle de production continue d’OSCN- a été mis au point par oxydation du thiocyanate potassique par l’H2O2, produit selon le modèle précédent sous l’action de la LPO. Des dosages répétés ont également été effectués pour caractériser ce modèle. Ces dosages ont été réalisés à l’aide d’acide 2-nitro-5-thiobenzoique, composé obtenu en rompant un pont disuflure de l’acide 5,5-dithiobis(2-nitrobenzoique). Des expositions continues de 45μL de solution bactérienne aux inocula 107, 105, 104 et 102 ont été effectuées dans des microplaques, en présence de 5μL de solution de D-glucose+glucose oxydase ou de 5μL de solution de D-glucose+glucose oxydase+LPO+thiocyanate sur des durées de 6heures. Des ratios de survie en comparaison à des solutions bactériennes non exposées au stress oxydatif ont ensuite été calculés.

Notre modèle de production d’H2O2 permet une production de 400 à 500μmol/L à partir d’7h et stable pendant 24h. Celui produisant l’OSCN- permet une production de 100μmol/L à partir de 7h et stable pendant 34h. L’exposition de PA14 à l’H2O2 a entrainé une survie d’environ 40 % stable sur 6heures pour les inocula 107 et 105. L’inoculum 102 ne montrait aucune survie et l’inoculum 104 montrait une survie initiale de 40 %, diminuant jusqu’à 20 % à partir de 4heures. L’exposition de PA14 à l’OSCN- a entraîné une survie d’environ 40 % stable sur 6heures pour les inoculas 107, 105 et 104. L’inoculum 102 avait une survie initiale de 40 %, diminuant jusqu’à 20 % environ à partir de 4heures.

Nous avons pu mettre au point et caractériser deux modèles de production continue d’H2O2 et d’OSCN- se rapprochant de l’activité physiologique du poumon. Ces modèles ont pu être utilisés pour étudier des survies de diverses souches, initialement de laboratoire. L’exposition à différentes souches cliniques de pneumopathies nosocomiales est actuellement en cours afin d’étudier la résistance au stress oxydatif avec des phénotype de résistance aux antibiotiques différents.