La signalisation intracellulaire du GM-CSF dans des monocytes circulants, des macrophages dérivés de monocytes et des macrophages pulmonaires humains - 20/03/24

Le GM-CSF est un facteur de croissance essentiel pour la maturation des macrophages alvéolaires. Il se fixe sur son récepteur hétérodimérique, activant de façon constitutive Janus Kinase 2 et la phosphorylation du facteur de transcription STAT5. Nous avons comparé la signalisation intracellulaire du GM-CSF évaluée par la phosphorylation de STAT5 dans trois types cellulaires: monocytes circulants (MOs), macrophages dérivés des monocytes (MDMs) et macrophages pulmonaires humains (MPs).

Le tissu pulmonaire était issu de pièces d’exérèses chirurgicales et les MPs étaient obtenus après dissection puis adhérence au support de culture ou après digestion enzymatique et tri cellulaire par le cytomètre de flux CytoFlex SRT (Beckman Coulter©). Les MOs étaient isolés à partir des cellules mononuclées sanguines de donneurs sains et les MDMs obtenus après 6jours de culture des MOs en présence de GM-CSF (50ng/mL) puis 24h sans facteur de croissance. Les cellules étaient stimulées par du GM-CSF (10 ou 50ng/mL) pendant 30minutes avant d’être fixées, perméabilisées et marquées (CD₄₅, HLA-DR, CD₄₃, CD₂₀₆, CD₁₄, CD₁₆, pSTAT5) puis analysées en cytométrie de flux. pSTAT5 était également révélé par Western Blot (Cell Signaling©) à partir des lysats de MOs, MDMs et MPs après stimulation par du GM-CSF (10ng/mL, 10minutes). L’expression de la chaine alpha du GM-CSFR était étudiée par microscopie confoncale sur des cultures de MOs et MPs (anticorps anti-CD₁₁₆, Invitrogen©).

La chaîne alpha du GM-CSFR était exprimée au même niveau par les MOs et MPs. Une stimulation par du GM-CSF à 10 et 50ng/mL, induisait une augmentation significative de la proportion de cellules pSTAT5+ (respectivement 28±6 % et 62±9 %) dans les MOs. Par contre, l’induction de pSTAT5 par le GM-CSF exogène n’était pas retrouvée en cytométrie de flux dans les cultures de MDMs et de MPs. L’analyse en cytométrie de flux des sous-populations monocytaires après digestion enzymatique de tissu pulmonaire humain montrait une induction de pSTAT5 après stimulation par du GM-CSF (10ng/mL) dans les monocytes (CD₄₅ +Cd14+ CD₂₀₆−) mais pas dans les macrophages alvéolaires (CD₄₅+HLADR+CD₂₀₆+CD₄+) ni dans les macrophages interstitiels (CD₄₅ +HLADR+CD₂₀₆ +CD₄₃−). Au cours du processus de différenciation en MDMs, l’induction de pSTAT5 après stimulation par du GM-CSF (10ng/mL) était clairement observée dans les MOs mais diminuait significativement après 2 et 4jours de culture et n’était plus identifiable après les 7jours de culture nécessaires à la différenciation des MOs en MDMs. En Western Blot, après stimulation par du GM-CSF (10ng/mL, 10minutes), l’induction de pSTAT5 était significativement plus importante dans les MOs que dans les MDMs et MPs.

La signalisation intracellulaire du GM-CSF, évaluée par la phosphorylation de STAT5, est inhibée au cours du processus de différenciation des monocytes en macrophages (MDM et MP), passant en dessous des seuils de détection en cytométrie de flux. La perte de sensibilité au GM-CSF dans des cellules pleinement différenciées pourrait être en rapport avec une exposition chronique au GM-CSF et la mise en jeu de phénomènes de rétrocontrôle.