Analyses fonctionnelles de variants dans NKX2,1 associés à des phénotypes respiratoires très sévères - 12/01/25

Les variations dans le gène codant pour le facteur de transcription NK2 homeobox 1 (NKX2,1) sont associées au syndrome cerveau–poumon–thyroïde comprenant généralement une chorée ou une hypotonie néonatale, une hypothyroïdie périphérique congénitale et une atteinte respiratoire pouvant être très sévère [1Nattes E., Lejeune S., Carsin A., Borie R., Gibertini I., Balinotti J., et al. Heterogeneity of lung disease associated with NK2 homeobox 1 mutations Respir Med 2017 ;  129 : 16-23 [inter-ref]

Cliquez ici pour aller à la section Références]. NKX2,1 régule en partie la transcription des gènes des protéines du surfactant, et des gènes codant pour la thyroglobuline (TG) et la thyroperoxidase (TPO). Nous rapportons trois patients avec des atteintes respiratoires sévères d’évolution fatale hospitalisés dans notre service de réanimation pédiatrique, dont une patiente présentant une histologie pulmonaire de dysplasie acineuse [2Soreze Y., Nathan N., Jegard J., Hervieux E., Clermidi P., Sileo C., et al. Acinar dysplasia in a full-term newborn with a NKX2,1 variant Neonatology 2023 ;  121 (1) : 133-136

Cliquez ici pour aller à la section Références]. Les 3 patients ont bénéficié d’un diagnostic moléculaire retrouvant des variants de NKX2,1 prédits comme pathogènes. Ce travail avait pour objectif d’en étudier in vitro les conséquences fonctionnelles.

Les plasmides rapporteurs TG, TPO, SFTPB et SFTPC et les plasmides d’expression NKX2,1_WT et PAX8_WT nous ont été donnés par les équipes Inserm UMR S-938 et U1016. NKX2,1 a été cloné dans le vecteur pcDNA3,1, puis les plasmides d’expression de nos 3 variants d’intérêt pNKX2,1_Y214C, pNKX2,1_G14À et pNKX2,1_R165W ont été obtenus par mutagenèse dirigée. Des cellules HEK 293T et A549 ont été co-transfectées avec les plasmides d’expression NKX2,1 et PAX8 et les plasmides rapporteurs SPB, SPC, TG et TPO. Après 48h de transfection, l’expression protéique a été vérifiée par western blot et des essais luciférase ont été réalisés pour tester l’activation des promoteurs de SPB, SPC, TG et TPO par NKX2,1 (WT et muté) et par PAX8 pour les promoteurs thyroïdiens. Sur les pièces de biopsies pulmonaires des patients 1 et 2, des études en immunohistochimie ont été réalisées.

Les transfections de NKX2,1 et PAX8 étaient effectives après 48h. Les essais luciférase ont montré que NKX2,1_WT entraînait une activation des promoteurs de SFTPB, STFPC, TG et TPO. Il y avait une absence totale d’activation des promoteurs de SFTPB, STFPC, TG et TPO par NKX2,1_p. Y214C dans nos conditions expérimentales. NKX2,1_p. R165W et NKX2,1_p. G14À ont été capables d’activer les promoteurs de SFTPB, STFPC, TG et TPO. L’analyse en immunohistochimie de la biopsie pulmonaire de la patiente 1 a montré une absence d’expression de pro-SPC et SPC comparé au témoin et au patient 2.

Nous avons montré que le variant Y214C situé dans l’homéodomaine de NKX2,1 ne permettait pas d’activer les promoteurs testés et était associé au phénotype le plus sévère. Nous émettons l’hypothèse que la sévérité des patients avec un variant dans NKX2,1 peut être due à l’inactivation des promoteurs des gènes et à la localisation du variant sur le site fonctionnel de NKX2,1.